【導讀】727型分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及**生長濃度的定量。 分光光度計的簡單試驗方法分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長

727型分光光度計已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實驗室常規(guī)儀器。常用于核酸，蛋白定量以及**生長濃度的定量。 分光光度計的簡單試驗方法分光光度計采用一個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光源透過測試的樣品后，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。 核酸的定量 ?核酸的定量是分光光度計使用頻率***高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的***高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實驗者*****的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。 事實上，分光光度計的設計試驗方法和工作試驗方法，允許吸光值在**范圍內(nèi)變化，即儀器有**的準確度和**度。如EppendorfBiophotometer的準確度≤%（1A）。%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值**、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了**程度減少顆粒對測試結果的影響，，。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結果穩(wěn)定。

從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。***后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的***小體積等多個操作事項。? 除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A 280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是 280 nm。純凈的樣品，比值大于（DNA）（RNA）。如果比值低于，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A 230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于。A 320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。 ?蛋白質(zhì)的直接定量（UV法） ?這種方法是在280 nm波長，直接測試蛋白。選擇 Warburg公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。 蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要**320 nm的“背景”信息，設定此功能“開”。與測試核酸類似，要求 A 280 的吸光值至少大于，之間。實驗中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A 280的吸光值的變化范圍不超過 1%，表明結果非常穩(wěn)定。 ?漂移的原因是因為 Warburg公式吸光值換算成濃度，乘以**的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩(wěn)定。 ?蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA 的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。 ?比色法蛋白質(zhì)定量 蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數(shù)目直接相關，從而反應蛋白質(zhì)濃度。 ?比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。 Lowry 法：以***早期的 Biuret 反應為基礎，并有所改進。蛋白質(zhì)與Cu2+反應，產(chǎn)生藍色的反應物。但是與 Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。 BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生 Cu+，后者與 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于 Lowry 法，操作簡單，敏感度高。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。 ? Bradford 法：這種方法的試驗方法是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結合反應，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595 nm。其**的特點是，敏感度好，是 Lowry 和 BCA 兩種測試方法的 2倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時，方便結果；而且與一系列干擾 Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。***主要的缺點是不同的標準品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。 ?某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller 等測試人奶中的蛋白，結果 Lowry，BCA測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標準樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以 BSA 作標準品， mg / ml，以 a 球蛋白作標準品，濃度 mg /ml。因此，在選擇比色法之前，***好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標準蛋白作標準品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應后的顏色是有**的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標準樣品），都必須在此時間內(nèi)測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，***好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因為反應后的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。 ?**細胞密度（OD 600） 實驗室確定**生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗和目測推斷**的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定**細胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數(shù)，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即**培養(yǎng)一段時間后，與培養(yǎng)基反應，發(fā)生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持**懸浮狀態(tài)。 ?分光光度計的重要配件 —— 比色杯 比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測試樣品。

?由于另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經(jīng)存在一種既可用于核酸、紫外蛋白質(zhì)定量，亦可用于蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette?塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發(fā)展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制藥等相關實驗室的**設備之一。?

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重慶分子熒光光度計在日常使用當中使人痛疼的問題應該是一些故障的發(fā)生吧，當發(fā)生故障后很多人都不如何解決，只能夠請專業(yè)的維修師傅來進行維修。這樣不僅浪費了時間還浪費了不必要的開銷，下面跟著小編來了解一下重慶分子熒光光度計常見的三種問題的解決方法吧首先是重慶分子熒光光度計的點火問題在分析工作中，經(jīng)常會碰到部分重慶分子熒光光度計點火線圈不亮，無法正常點火。首先要檢查點火爐絲是否正常，如爐絲斷則需要更換爐絲，如爐絲亮但點不燃火焰，就需要檢查燃氣或控制閥，檢查爐絲與爐芯的位置是否合適。排除這些故障后重慶分子熒光光度計可正常點火。然后是無信號強度問題在重慶分子熒光光度計檢定過程中，經(jīng)常遇到重慶分子熒光光度計測量標準溶液后無響應熒光強度。遇到此類問題，首先應該檢查靜態(tài)光源，檢查元素燈是否點亮。若重慶分子熒光光度計燈能量正常，說明重慶分子熒光光度計電路部分正常，則需要進一步檢查反應系統(tǒng)或原子化系統(tǒng)。檢查重慶分子熒光光度計泵管松緊是否合適，管道有無堵塞破裂。如出現(xiàn)上述情況，試劑沒有進系統(tǒng)，重慶分子熒光光度計沒有發(fā)生氧化還原反應，則不會產(chǎn)生信號。更換管道，調(diào)整泵管松緊可以解決此問題。檢定標準溶液的酸度或還原劑濃度不夠，不能生成被測元素的氫化物，無法正常原子化也會造成重慶分子熒光光度計無響應熒光強度，這就需要檢查配置標準溶液所使用的酸和還原劑濃度。后重慶分子熒光光度計靈敏度低怎么解決？在檢定過程中，由于要檢定重慶分子熒光光度計的測量線性及檢出限，需要在重慶分子熒光光度計上測量0.0 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL砷銻混合標準溶液的線性。重復測量3次，記錄熒光強度值，按照線性回歸計算斜率b，再對空白溶液連續(xù)進行11次熒光強度測量，計算其標準偏差s0，然后計算重慶分子熒光光度計的檢出限QL。JJG939-2009《原子熒光光度計檢定規(guī)程》要求重慶分子熒光光度計檢出限為0.4 ng。檢定中經(jīng)常碰到重慶分子熒光光度計靈敏度低，調(diào)整重慶分子熒光光度計的燈電流和負高壓后仍無法達到檢定規(guī)程的要求，這就需要排查解決靈敏度低的問題。

　　關鍵詞摘取：分光光度計 可見光分光光度計 紫外分光光度計 超微量分光光度計

　　分光光度計的限制性條件主要表現(xiàn)為;通過溶液的光必須是平行的;通過溶液的光必須是單色光;待測溶液必須是純凈的、均勻的且濃度不宜過高，這是瑯伯-比爾定律**的三個前提條件。

　　但是在實際的分光光度計的制造和使用過程中這三個條件是不可能達到的。

　　其一：因為光是直線傳播的，在分光光度計制造過程中，燈源發(fā)出的光是發(fā)散的，經(jīng)過聚焦鏡進行聚焦等直到經(jīng)過溶液的整體過程中，光是不可能平行的。

　　其二：燈源發(fā)出的光是復合光，經(jīng)過狹縫，再經(jīng)過光柵分光等步驟，因為受到狹縫和光柵本身的限制，光柵分光不可能達到純單色光。還有光度計的整體設計問題，光度計不可能沒有其它的雜光存在。

　　其三：用戶的溶液也不可能是純凈的，也會含有一些雜質(zhì)，這些對光度的吸收都會存在影響。除以上三個方面的影響外，在實際的光度計應用過程中還會存在其他因素的影響，例如：

　　1、經(jīng)過比色皿的光是否垂直;

　　2、比色皿寬度是否為10mm的標準值;

　　3、測試波長是否準確;

　　4、程序設計是否存在漏洞等等，都會直接影響到利用瑯伯-比爾定律計算出的結果。