液相色譜柱的使用注意事項及再生 1 、色譜柱的使用說明：
（ 1 ）、 色譜柱使用前注意事項：
色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價報告所示的流動相。在使用前，**要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應(yīng)先用 10 ％左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出，堵塞色譜柱。
（ 2 ）、 流動相：
流動相中所使用的各種有機(jī)溶劑要盡可能使用色譜純，配流動相的水***好是超純水或全玻璃器皿的雙蒸水。如果將所配得流動相再經(jīng)過 0.45μm 的濾膜過濾一次則更好，尤其是含鹽的流動相。另外，裝流動相的容器和色譜系統(tǒng)中的在線過濾器等裝置應(yīng)該定期清洗或更換。
以常規(guī)硅膠為基質(zhì)的鍵合相填料通常的 PH 值適用范圍是 2.0-8.0 ， BDS C18 適合于堿性化合物， PH 值適用范圍為 2.0-10.0 。當(dāng)必須要在 PH 值適用范圍的邊界條件下使用色譜柱時，每次使用結(jié)束后立即用適合于色譜柱儲存并與所使用的流動相互溶的溶劑清洗，并**置換掉原來所使用的流動相。
（ 3 ）、 樣品：
樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱（ SPE ）對樣品進(jìn)行預(yù)處理；若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。
2 、色譜柱的保存
（ 1 ）、 反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：
使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應(yīng)用 10% 的甲醇 / 水沖洗 30 分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗 30 分鐘。 注意：不能用純水沖洗柱子，應(yīng)該在水中加入 10% 的甲醇，防止將填料沖塌陷。
（ 2 ）、 長期保存色譜柱：
如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度***好是室溫。
3 、色譜柱的再生
因為色譜柱是消耗品，隨著使用時間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降。
（ 1 ）、 反相柱的再生 ： 依次采用 20-30 倍的色譜柱體積的甲醇：水 =10 ： 90 （ V/V ），乙腈，異丙醇作為流動相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。
（ 2 ）、 正相柱的再生 ： 依次以 20-30 倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。
4 、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法
色譜柱在使用中***常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時間使用過程中緩慢增加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點(diǎn)：
（ 1 ）、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；
（ 2 ）、色譜柱頭的填料被樣品污染；
（ 3 ）、色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出；
（ 4 ）、流動相 PH 值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。
解決辦法如下：
（ 1 ）、如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正常壓力，或者卸下色譜柱頭，將其放在 10 ％的稀硝酸內(nèi)超聲清洗 10 分鐘，后再用純水超聲 10 分鐘，重新裝入色譜柱。
（ 2 ）、如確定色譜柱頭的填料被污染，將柱頭螺絲卸下，挖出柱內(nèi)前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔細(xì)修復(fù)后，重新安裝上柱頭螺絲。
（ 3 ）、如確定定是鹽結(jié)晶，用 10% 的甲醇 / 水沖洗色譜柱使柱內(nèi)鹽**溶解，再換高濃度甲醇。
（ 4 ）、如果因 PH 值使用不當(dāng)，很難恢復(fù)。
　　【***** 使用手冊】液相色譜是目前應(yīng)用多的色譜分析方法，液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。液相色譜的流動相通常是各種低沸點(diǎn)溶劑和水溶液。它是影響分離的一個非常重要因素。在實際工作中，流動相的選擇和優(yōu)化是確定色譜分析的主要工作。
 　　選擇方法
 　　1、由強(qiáng)到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩沖溶液)進(jìn)行試驗，這樣可以很快地得到分離結(jié)果，然后根據(jù)出峰情況調(diào)整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
 　　2、三倍規(guī)則 ：每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規(guī)則。這是一個聰明而又省力的辦法。調(diào)整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
 　　3、粗調(diào)轉(zhuǎn)微調(diào)：當(dāng)分離達(dá)到**程度，應(yīng)將有機(jī)溶劑10%的改變量調(diào)整為5%，并據(jù)此規(guī)則逐漸降低調(diào)整率，直至各組分的分離情況不再改變。
 　　脫氣方法
 　　1、吹氦脫氣法
 　　利用氦氣在液體中溶解度比空氣低的特性，在0.1MPa壓力下，以約60mL/min流速通入流動相儲液容器中10～15min，可以很有效地從流動相中排除溶解的空氣，能排除接近80%的氧氣。采用一個分布式噴射流裝置，一體積的氦氣可從流動相中將等體積的幾乎**氣體排除。這意味著1L氦氣通過1L流動相就可完成排氣這個工作。這種脫氣方法雖然好，但氦氣價格較高，很少使用。
 　　2、加熱回流法
 　　此法的脫氣效果較好。在操作時要注意冷凝塔的冷卻效率，否則溶劑會丟失，混合流動相的比例會有變化。
 　　3、抽真空脫氣法
 　　此法可使用真空泵，降壓至0.05～0.07MPa，即可除去溶解的氣體。但是由于真空脫氣會使混合溶劑組成發(fā)生變化，從而影響到實驗的重現(xiàn)性，因此多用于單溶劑體系的簡單分析。
 　　4、超聲波脫氣法
 　　將欲脫氣的流動相置于超聲波清洗器中，用超聲波震蕩10～20min。此法的脫氣效果差。
 　　5、在線脫氣法
 　　HPLC儀器均可配置專門的在線脫氣機(jī)。在線脫氣使用簡單，低故障，有效。
 　　注意事項
 　　1、流動相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標(biāo)準(zhǔn)的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，**微粒和灰塵。 在送液泵內(nèi)，為了防止雜物(固體)進(jìn)入流路，裝有吸濾器，但網(wǎng)孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此，建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣，如不脫氣，在溶劑混合時，或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡，會導(dǎo)致泵誤動作和輸液不暢，檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。
 　　2、流動相恢復(fù)到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時，流動相在恢復(fù)到室溫前，基線水平很難穩(wěn)定，特別是發(fā)生漂移，也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機(jī)溶劑混合時，混合液變化大，往往會與室溫相差很大，務(wù)必注意。
 　　3、做HPLC流動相的試劑應(yīng)用HPLC級的、水應(yīng)用二次蒸餾水，水相流動相需經(jīng)常更換，防止長菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而干擾分析結(jié)果。
 　　4、流動相的pH值過高或過低，流動相使用純水，使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液，使用離子對試劑等，均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞，這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的
 　　5、用緩沖鹽做流動相時，在使用前和使用后都要用水清洗流路，禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
 　　6、若需要使用含鹽的流動相，使用前請務(wù)必過濾。并且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機(jī)相(有機(jī)相含量應(yīng)不低于10%)的溶液沖洗，以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液，建議現(xiàn)用現(xiàn)配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
 　　7、進(jìn)行梯度實驗時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性，避免因流動相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時，用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲存流動相后在接柱子。
 　　8、在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：先用甲醇水做流動相，然后在用正己烷做流動相時，**要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水，然后用正己烷沖洗異丙醇，反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。
 　　9、儀器在短期(兩三天)不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應(yīng)用甲醇。
 　　10、對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。
 　　11、當(dāng)流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大，導(dǎo)致泵的流速降低?？蛇m當(dāng)提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可。
 　　12、流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強(qiáng)度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了后，應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
 　　13、用于檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
 　　14、注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。        在液相色譜儀的日常分離分析工作中，其色譜柱的正確使用和維護(hù)**重要，色譜柱使用是否得當(dāng)，直接影響色譜柱的壽命及液相色譜儀的使用效果，在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)儀器。　　1、柱子在裝卸、更換時，動作要輕，接頭擰緊要適度。必須防止較強(qiáng)的機(jī)械振動，以免柱床產(chǎn)生空隙。　　2、如果儀器用來做常規(guī)分析，樣品種類有限，但分析次數(shù)多，則不妨為每一類常規(guī)分析配置一根 柱，這樣有助于延長柱子的壽命。　　3、避免壓力和溫度的急劇變化及**機(jī)械震動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會影響柱內(nèi)的填充狀況;柱壓的突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。　　4、應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)?*是水，反之亦然。　　5、如使用柱溫控制裝置時，應(yīng)注意在通人流動相后才能升溫。　　6、一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會迅速降低柱效。　　7、選擇使用適宜的流動相，以避免固定相被破壞。有時可以在進(jìn)樣器前面連接一個預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時，預(yù)柱為硅膠，可使流動相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。　　8、避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注人柱內(nèi)，需要對樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一個保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。　　9、保存液相色譜儀的色譜柱時應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時間。