【***** 使用手冊(cè)】液相色譜法(High Performance Liquid Chromatography HPLC)又稱(chēng)“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。如今，該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用。尤其是在**分析領(lǐng)域，有著廣泛的應(yīng)用?！　∫合嗌V在**分析中的應(yīng)用，主要考慮試樣的預(yù)處理和分析柱、檢測(cè)器的選擇。在試樣的預(yù)處理上，日前興起的固相(微)萃取使得許多含量低的成分得到精制提純，從而適于液相色譜的測(cè)定。中藥中有些紫外吸收，或無(wú)特征紫外吸收的成分，直接用液相色譜測(cè)定，其靈敏度和分離度都不盡人意，利用柱前或柱后衍生化法可使這些成分較地測(cè)定出來(lái)。對(duì)于極性大、脂溶性差物質(zhì)，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸鈉作為離子對(duì)試劑，降低其極性，延長(zhǎng)柱上的保留時(shí)間，取得較好的分離較果。　　將液相色譜和質(zhì)譜這兩個(gè)強(qiáng)有力的分析技術(shù)在線(xiàn)連接在一起，經(jīng)過(guò)三十年的發(fā)展已成為一項(xiàng)較為成熟的分析手段，但是它從形成伊始就存在著問(wèn)題：從液相色譜流進(jìn)質(zhì)譜時(shí)，流動(dòng)相的變化、溶劑的組成、高溫高壓離子化的問(wèn)題制約著這種聯(lián)用技術(shù)發(fā)展。大氣壓離子化接口具有去除溶劑和離子化的雙重功效，它的引入使得該技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。電噴霧離子源是一種軟電離技術(shù)，一般只生成(M H) 和(M-H)-兩種分子離子峰，選擇性監(jiān)測(cè)(mz)190的負(fù)分子離子峰，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度、專(zhuān)一性，滿(mǎn)足了低濃度**研究的需求?！　∪S液相色譜法可以同步測(cè)定葛根素和阿魏酸兩種指標(biāo)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明：如果選擇合適的柱溫等色譜條件，乙醇作為反相液相色譜流動(dòng)相，分析中藥及中成藥中有效成分，既**又準(zhǔn)確。結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)，普通的檢測(cè)器難以檢測(cè)出來(lái)，液相色譜-電化學(xué)法可以有效地測(cè)定黃連粉中僅差一個(gè)基團(tuán)的黃芩苷和黃芩素的含量。樣品經(jīng)色譜柱分離后收集，再經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)熒光強(qiáng)度，影響因素多，測(cè)定復(fù)雜。改進(jìn)后的液相色譜-熒光法則可以不經(jīng)衍生化和收集分離物，只經(jīng)化學(xué)處理除雜，濃縮后直接進(jìn)樣即可。用該法測(cè)定貫葉連翹中金絲桃素的含量也取得了較好的結(jié)果。液相色譜-示差折光測(cè)黃芪精口服液中黃芪甲苷的含量也都取得了較為滿(mǎn)意的結(jié)果。對(duì)于只有紫外末端吸收，用紫外檢測(cè)時(shí)靈敏度低，基線(xiàn)易漂移，示差折光檢測(cè)其易受外界條件干擾，蒸發(fā)散射檢測(cè)器能克服以上不足，響應(yīng)值只與樣品質(zhì)量有關(guān)，其信號(hào)相應(yīng)與質(zhì)量成正比，不同化合物，質(zhì)量相同則信號(hào)相應(yīng)基本一致。蒸發(fā)光散射檢測(cè)法是基于不揮發(fā)樣品分子對(duì)光的散射程度與其質(zhì)量成正比，與其所含基團(tuán)性質(zhì)無(wú)關(guān)。只要選擇適當(dāng)?shù)臋z測(cè)器參數(shù)，便可使流動(dòng)相和溶劑**氣化，不產(chǎn)生信號(hào)，而樣品中的各個(gè)組分以不揮發(fā)粒子存在，對(duì)光有散射，以被檢測(cè)出來(lái)。因此，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器可用于含不同基團(tuán)的多組分同時(shí)分離、分析。和紫外、熒光等方法相比，蒸發(fā)光散射檢測(cè)法對(duì)不同物質(zhì)有近似相同的響應(yīng)因子?！　≡谡劦剿幱幂o料檢測(cè)中的其他液相色譜檢測(cè)方法時(shí)，液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為微量元素測(cè)定的有效途徑之一，液相色譜高分離度與電感耦合等離子體質(zhì)譜低檢測(cè)性、寬動(dòng)態(tài)線(xiàn)性范圍及能同時(shí)測(cè)定多種元素、跟蹤元素的變化等特點(diǎn)融合，目前已廣泛的用于食品、環(huán)境、體內(nèi)外**分析中微量元素的測(cè)定。該方法應(yīng)用于藥用輔料中微量元素砷、汞、鉻等檢測(cè)的探索性研究項(xiàng)目已在試驗(yàn)室開(kāi)展。目前雖罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，隨著技術(shù)的成熟與儀器的發(fā)展，其在藥用輔料檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng)用前景。同時(shí)，液相色譜-核磁共振聯(lián)用技術(shù)因儀器昂貴，核磁共振靈敏度相對(duì)較低，液相色譜需使用氘代溶劑，溶劑信號(hào)易對(duì)樣品產(chǎn)生干擾等，使其在**分析中廣泛應(yīng)用存在**障礙，但核磁共振在結(jié)構(gòu)分析方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能夠提供豐富的結(jié)構(gòu)信息，彌補(bǔ)液相色譜通用檢測(cè)器只能得到非常有限的結(jié)構(gòu)信息的不足，在實(shí)際藥用輔料雜質(zhì)分析中已進(jìn)入使用階段?！　【C合上述研究成果可以知曉，目前液相色譜法在**分析領(lǐng)域的應(yīng)用是多方面的。而且為了滿(mǎn)足特定的檢測(cè)需求，液相色譜與多種其他方法、其他儀器聯(lián)合，不斷改進(jìn)自身缺陷，為**分析提供更佳的解決方案。相信這項(xiàng)技術(shù)在未來(lái)還會(huì)有更廣闊的應(yīng)用空間。 液相色譜流動(dòng)相說(shuō)明

　　流動(dòng)相相當(dāng)于液相的血液，可以想象對(duì)液相的重要程度。那么流動(dòng)相都需要注意什么呢?　　01、過(guò)濾溶劑　　溶劑在使用前**要用0.5μm的過(guò)濾器過(guò)濾，如果使用固體化學(xué)試劑(緩沖鹽)配制流動(dòng)相，過(guò)濾特別重要，不能讓固體微粒污染泵，阻塞進(jìn)樣器和柱頭過(guò)濾片。本實(shí)驗(yàn)室有水溶性和脂溶性?xún)煞N過(guò)濾膜供選擇(反光面朝上)，過(guò)濾水溶性流動(dòng)相時(shí)(如甲醇/水)，先用1～2mL甲醇潤(rùn)濕過(guò)濾膜，有助于快速抽濾?！　?2、保持儲(chǔ)液瓶的清潔　　用普通溶劑瓶作流動(dòng)相儲(chǔ)液器應(yīng)不定期廢棄瓶子，***后一次應(yīng)用HPLC級(jí)的水或溶劑清洗，不能在清洗過(guò)程中留下污跡?！　?3、保證溶劑的質(zhì)量　　**要用HPLC級(jí)的溶劑，水也應(yīng)達(dá)到HPLC級(jí)，同樣也要使用高純度的緩沖鹽?！　∫恍┮蛄鲃?dòng)相引起的常見(jiàn)問(wèn)題　　01、流動(dòng)相脫氣不充分　　流動(dòng)相受熱，或者流動(dòng)相不同組分混合時(shí)會(huì)有氣體產(chǎn)生，氣泡進(jìn)入泵內(nèi)引起壓力波動(dòng)，增加噪音，色譜圖上出現(xiàn)毛刺。可試用下列方法解決問(wèn)題：流動(dòng)相再脫氣;采用更有效的脫氣方法或兩種方法配合使用;改系統(tǒng)內(nèi)混合為系統(tǒng)外預(yù)混合。　　02、流動(dòng)相供給不暢　　流動(dòng)相用完，管道中吸入氣體引起泵壓力不穩(wěn)。應(yīng)經(jīng)常觀察儲(chǔ)液器中流動(dòng)相的量，加足流動(dòng)相保證所有的樣品分析完畢。輸液管道上裝沉子沉至瓶底，儲(chǔ)液器蓋上留一小孔正好夾住進(jìn)液管，使其不能上下移動(dòng)?！　∵^(guò)濾器阻塞引起管道和泵腔空化，壓力不穩(wěn)。過(guò)濾器被微粒所阻塞或長(zhǎng)霉，去掉過(guò)濾器后如果系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)正常，說(shuō)明已找出問(wèn)題，換上新的過(guò)濾器則可。有時(shí)候換上新的過(guò)濾器仍然不暢，那就需要查查流動(dòng)相的制備過(guò)程，或者換大孔徑的過(guò)濾器。不管如何，流動(dòng)相都需要重新過(guò)濾。　　流速過(guò)高、阻力大，造成空化現(xiàn)象，這是由于過(guò)濾器孔徑、管道內(nèi)徑、流速和溶劑黏度等引起的。如果流速大于10mL/min，常會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象?！　∈褂孟铝蟹椒ń鉀Q：　　(1)使用低流速;　　(2)換大孔徑的過(guò)濾器;　　(3)增加進(jìn)液管道內(nèi)徑;　　(4)抬高或加壓儲(chǔ)液器;　　(5)不用過(guò)濾器，但流動(dòng)相**要先過(guò)濾;　　(6)儲(chǔ)液器蓋子太緊，在儲(chǔ)液器內(nèi)形成真空，打出的流動(dòng)相不連續(xù)。應(yīng)松開(kāi)蓋子或留有1mm的縫隙;　　(7)進(jìn)液管道阻塞或彎曲使泵抽不到液，注意調(diào)整進(jìn)液管道或更換新的。其它問(wèn)題包括滲漏或接頭松動(dòng)、泵部件損壞等，都能引起供液不正常。　　03、流動(dòng)相和儲(chǔ)液器被污染　　由于污染，噪音越來(lái)越大，檢測(cè)器基線(xiàn)上升。污染物可能被泵以穩(wěn)定的濃度打入系統(tǒng)，而再以穩(wěn)定的濃度流出來(lái)，所以在色譜圖中不出多余的峰。用梯度洗脫時(shí)弱流動(dòng)相可以使污染物聚在柱頂，流動(dòng)相強(qiáng)度增加后污染物可能被洗脫出來(lái)一個(gè)大的偽峰。有時(shí)基線(xiàn)噪音突然增大或突然提高，都是因?yàn)榉磸?fù)加進(jìn)新的流動(dòng)相或系統(tǒng)用得太久(通宵)所造成的。新加進(jìn)的流動(dòng)相有污染物或者流動(dòng)相長(zhǎng)霉，繁殖了**。　　臟的儲(chǔ)液器會(huì)污染清潔的流動(dòng)相。每種流動(dòng)相備有專(zhuān)用的儲(chǔ)液器，或者定期報(bào)廢儲(chǔ)液器?！　×鲃?dòng)相污染來(lái)自這幾個(gè)方面　　04、試劑質(zhì)量不高，玻璃器皿不合格;　　微生物的影響;　　配制流動(dòng)相時(shí)操作不當(dāng)?shù)?　　因此要求高純度化學(xué)試劑和HPLC級(jí)溶劑;　　玻璃器皿按規(guī)定清洗干凈;　　為防止微生物生長(zhǎng)，每天要用甲醇清洗系統(tǒng);　　懷疑系統(tǒng)內(nèi)生長(zhǎng)了微生物，可用稀硝酸沖洗即可(注意不要損壞柱和管道系統(tǒng));　　真空脫氣時(shí)防止泵油帶入流動(dòng)相;　　用清潔的惰性塞子、攪棒、過(guò)濾器和玻璃器皿配制流動(dòng)相;　　已經(jīng)污染的流動(dòng)相**要廢棄掉。