【導讀】紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector 紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector 簡稱紫外檢測器（UV），是基于溶質(zhì)分

紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector

紫外吸收檢測器 ultraviolet absorption detector 簡稱紫外檢測器（UV），是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光的試驗方法設計的檢測器。因為大部分常見有機物質(zhì)和部分無機物質(zhì)都具有紫外吸收性質(zhì)，所以該檢測器是液相色譜中應用***廣泛的檢測器，幾乎所有液相色譜儀都配置了這種檢測器。它不**較好的選擇性和較高的靈敏度，而且對環(huán)境溫度、流動相組成變化和流速波動不太敏感，因此既可用于等度洗脫，也可用于梯度洗脫。其檢測靈敏度在mg/L至mg/L范圍。 可見光檢測器 visible light detector 可見光檢測器 visible light detector 又稱分光光度檢測器，是基于溶質(zhì)分子吸收可見光的試驗方法設計的檢測器。能夠直接采用可見光檢測的溶質(zhì)不是很多，而且多數(shù)靈敏度也不高，但采用具有高摩爾吸光系數(shù)的有機試劑（配位體和螯合劑）作為衍生化試劑進行柱前或柱后衍生操作的衍生化光度檢測法是相當有用的，特別是在金屬離子配合物液相色譜中的應用是相當成功的。 低壓梯度 low-pressure gradient 低壓梯度 low-pressure gradient 又稱外梯度，是在低壓狀態(tài)下完成流動相強度調(diào)整的梯度裝置。只需一個高壓泵，與等度洗脫輸液系統(tǒng)相比，就是在泵前安裝了一個比例閥，混合就在比例閥中完成。因為比例閥是在泵之前，所以是在常壓（低壓）下混合之后再增壓輸送到色譜柱的。 蒸發(fā)光散射檢測器克服常見的HPLC檢測難題 雖然陣法光散射檢測器(Evaportive light Scattering,ELSD)已經(jīng)開發(fā)生產(chǎn)15年，但是對于許多色譜工作者來說，它仍是一個新產(chǎn)品。**臺ELSD是由澳大利亞的Union Carbide研究實驗室的科學家研制開發(fā)的，并在八十年代初轉化為商品，八十年代以激光為光源的第二代ELSD面世。此后，通過不斷設計提高了ELSD的操作性能?，F(xiàn)在ELSD越來越多的作為通用型檢測器]用于**液相色譜，超臨界色譜（SFC）和逆流色譜中。ELSD**的優(yōu)越性在于能檢測不含發(fā)色團的化合物，如：碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑、**，并在沒有標準品和化合物結構參數(shù)未知的情況下檢測未知化合物 。 ELSD的通用檢測方法**了常見于傳統(tǒng)HPLC檢測方法中的難點，不同于紫外和熒光檢測器，ELSD的響應不依賴與樣品的光學特性，**揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響。ELSD 的響應值與樣品的質(zhì)量成正比，因而能用于測定樣品的純度或者檢測未知物。示差檢測器（RI）也可以說是一種通用型檢測器，打它靈敏度低，并與梯度脫洗不相容。質(zhì)譜是另一種通用型檢測器，但它的昂貴操作費用和復雜性限制了它的應用。 ELSD的獨特檢測方法，對于它的多種用途和高性能至為關鍵。ELSD檢測只要分為三個步驟：（1）用惰性氣體霧化脫洗液（2）流動相在加熱管（漂移管）中蒸發(fā)（3）樣品顆粒散射光后得到檢測。 討論: UV檢測的主要缺點在于紫外不吸收的化合物靈敏度很低。ELSD可以檢測**揮發(fā)性低于流動相的樣品。ELSD的通用性響應值使得ELSD響應值比UV響應值更能代表樣品的質(zhì)量 不同于紫外檢測只能使用不吸收紫外的流動相，ELSD能與**的揮發(fā)性流動相相容，不論其光學特性。您可根據(jù)樣品的溶解度或分離特性選擇流動相，例如選擇氯仿和丙酮用于脂類的分離以提高樣品的溶解性。用紫外檢測器定量未知物是困難的，因為樣品的紫外吸收值往往和代表樣品的質(zhì)量的色譜峰的大小無關。ELSD對幾乎所有的樣品給出一致的響應因子。因此可以通過和內(nèi)標比較定量未知化合物，此特性對于使用組合化合技術而合成的系列化合物的定量尤其有用。用組合合成技術合成的化合物通常是用HPLC聯(lián)合低波長紫外或質(zhì)譜檢測進行分析，但是，在缺乏已表面活性劑非常靈敏，并在梯度脫洗下維知結構參數(shù)已知的參照標準品情況下，兩種方法都不能準確的定量分析此種系列化合物。 熒光檢測 熒光檢測的主要缺點在于只有少數(shù)化合物產(chǎn)生熒光。大多數(shù)的分子不發(fā)熒光，但含有可衍生的官能團用于合成能發(fā)熒光的衍生物，例如，鄰苯二甲醛是一種常用熒光基團用于柱后衍生氨基酸。雖然熒光檢測很靈敏，但對于常見的樣品分析來說不需要如此高的靈敏度。因為ELSD的響應不依賴于熒光基團，所以不需要衍生，因此大大降低了樣品預處理和分析時間。 示差檢測： 雖然示差檢測在試驗方法上是通用型檢測器，但是它的靈敏度低，和梯度脫洗不相容，因此它對于HPLC來說不是理想的檢測器。室溫的變化會影響基線的穩(wěn)定性，大的溶劑前沿峰可能會掩蓋前期脫洗的色譜峰。因為ELSD在檢測前將流動相蒸發(fā)，所以基線的噪聲和漂移都很小，因此基線穩(wěn)定和樣品檢測的靈敏度高。流動相的蒸發(fā)使得ELSD和梯度脫洗相容，因而可提高色譜分離的分辨率和縮短分離時間。另外ELSD比RI檢測蔗糖靈敏度高和基線穩(wěn)定。 應用實例： 近年來，脂類在生物學和經(jīng)濟領域中的重要性正在日益引起廣泛的關注。脂類的分析方法對于許多研究工作，臨床使用和質(zhì)量控制方面都非常重要。大多數(shù)的脂類分子都缺乏適當?shù)陌l(fā)色團，因此脂類除非通過衍生化，否則不能用紫外檢測。一般但一樣品種含有的各種脂類其極性差異很大，弱項要達到個作分的***佳分離和分辨率需要使用梯度脫洗，因而限制了示差檢測器的使用。不同于UV和RI的局限性，ELSD是脂類檢測的有用工具。 碳水化合物不帶有發(fā)色團，因而不能用UV來檢測。他們通常用氨基柱或者陽離子交換樹脂分離。但是示差檢測器不是很靈敏，而且需要控制溫度來維持基線穩(wěn)定，不能與梯度脫洗相容。ELSD靈敏度高，基線穩(wěn)定，與梯度脫洗相容。 隨著高聚物和表面活性劑在許多行業(yè)中的廣泛應用，簡單和可靠的分析方法的尤為重要，他們通常是不含有發(fā)色團的復合分子。此類化合物不帶有適當?shù)陌l(fā)色團和分離是需要采用梯度脫洗意味著不能采用示差和紫外檢測器。ELSD檢測高聚物和表面活性劑可以保持基線穩(wěn)定。 在科研、臨床和生產(chǎn)的工藝控制上，**需要分析評估。目前，隨著日益增長的加速藥品開發(fā)的要求，藥品工作者需要一種開速的鑒定方法來測定帶物的代謝物、雜質(zhì)、降解物和各種天然產(chǎn)物，許多不含有適當?shù)陌l(fā)色團，限制了紫外檢測器的使用。示差比紫外檢測器的靈敏度要低，且不能與梯度脫洗相容，而復雜的藥品分析常需要梯度脫洗。ELSD的通用檢測能力和梯度相容性使得ELSD是**分析的理想工具。因為ELSD的響應接近于代表產(chǎn)品的質(zhì)量，所以即使在降解產(chǎn)物和雜質(zhì)的性質(zhì)不明確的情況下ELSD的使用為**雜質(zhì)分析提供***快速的方法。 結論： 蒸發(fā)光散射檢測器正日益成為分析碳氫化合物、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油、和其他難檢樣品的強大工具，多用途的ELSD能檢測**揮發(fā)相低于流動相的樣品，克服了常見于示差和紫外檢測器的缺點。 紫外-可見光（UV-VIS）檢測器 　　試驗方法： 基于Lambert-Beer定律，即被測組分對紫外光或可見光具有吸收，且吸收強度與組分濃度成正比。 很多有機分子都具紫外或可見光吸收基團，有較強的紫外或可見光吸收能力，因此UV-VIS檢測器既有較高的靈敏度，也有很廣泛的應用范圍。由于UV-VIS對環(huán)境溫度、流速、流動相組成等的變化不是很敏感，所以還能用于梯度淋洗。一般的液相色譜儀都配置有UV-VIS檢測器。 用UV-VIS檢測時，為了得到高的靈敏度，常選擇被測物質(zhì)能產(chǎn)生**吸收的波長作檢測波長，但為了選擇性或其它目的也可適當犧牲靈敏度而選擇吸收稍弱的波長，另外，應盡可能選擇在檢測波長下沒有背景吸收的流動相。 　　二極管陣列檢測器（diode-array detector, DAD）： 以光電二極管陣列（或CCD陣列，硅靶攝像管等）作為檢測元件的UV-VIS檢測器（圖8-15）。它可構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再入射到陣列式接受器上的**波長的信號，然后，對二極管陣列快速掃描采集數(shù)據(jù)，得到的是時間、光強度和波長的三維譜圖。與普通UV-VIS檢測器不同的是，普通UV-VIS檢測器是先用單色器分光，只讓特定波長的光進入流動池。而二極管陣列UV-VIS檢測器是先讓所有波長的光都通過流動池，然后通過一系列分光技術，使所有波長的光在接受器上被檢 直接紫外檢測： 所使用的流動相為在檢測波長下無紫外吸收的溶劑，檢測器直接測定被測組分的紫外吸收強度。多數(shù)情況下采用直接紫外檢測。 　　間接紫外檢測： 使用具有紫外吸收的溶液作流動相，間接檢測無紫外吸收的組分。在離子色譜中使用較多，如以具有紫外吸收的鄰苯二甲酸氫鉀溶液作陰離子分離的流動相，當無紫外吸收的無機陰離子被洗脫到流動相中時，會使流動相的紫外吸收減小。 　　柱后衍生化光度檢測： 對于那些可以與顯色劑反應生成有色配合物的組分（過渡金屬離子、氨基酸等），可以在組分從色譜柱中洗脫出來之后與合適的顯色劑反應，在可見光區(qū)檢測生成的有色配合物

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色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等，色譜柱效受柱內(nèi)外因素影響，為使色譜柱達到***佳效率，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結構及裝填技術。1、**液相色譜柱的保養(yǎng)色譜柱在使用前，***好進行柱的性能測試，并將結果保存起來，作為今后評價柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測試時是按照色譜柱出廠報告中的條件進行（出廠測試所使用的條件是***佳條件），只有這樣，測得的結果才有可比性。我們在對色譜柱使用前進行測試以后，我們要根據(jù)不同的情況對色譜柱進行保養(yǎng)：①反相色譜柱每天實驗后的保養(yǎng)：使用緩沖液或含鹽的流動相，實驗完成后應用10%的甲醇/水沖洗30分鐘，洗掉色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不能用純水沖洗柱子，應該在水中加入10%的甲醇，防止將填料沖塌陷。②長期保存色譜柱：如色譜柱要長時間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色譜柱時附送的堵頭堵上。儲存的溫度***好是室溫.2、**液相色譜柱的維護我們在使用新的色譜柱應該在我們自己的液相色譜儀上進行性能測試，即使用色譜柱附帶的檢驗報告上測試條件和樣品來測定該色譜柱的柱效。并且，在以后的使用中，應時常對色譜柱進行測試。而且在使用的過程中常常有堵塞的現(xiàn)象，造成這種現(xiàn)象的主要原因是①溶劑中的不溶物；②樣品中的不溶物；③泵進樣器等中的不溶物；④柱內(nèi)不溶物的形成等。如果當色譜柱堵塞以后我們可以對色譜柱進行修復，首先，使用含鹽緩沖液后（如離子對試劑）應用溶解性強的溶劑（如水）進行沖洗。其次，先斷開檢測器，然后用對來自樣品中的物質(zhì)有強溶解性的溶劑進行沖洗，對于反相色譜柱，可使用甲醇、乙睛、四氫呋喃、氯仿、庚烷等，在此條件下，應避免溶劑的pH低于2或高于8。***后如果經(jīng)過上述還是沒有修復，色譜柱壓力還是沒有下降，則要斷開檢測器，將色譜柱反方向放置，然后檢查柱壓，若壓力穩(wěn)定下降，則保持色譜柱反方向連接，用低于0.5ml/min流速沖洗一小時。如果壓力不下降，則要看內(nèi)置過濾器是否被堵塞，如果被堵塞應沖洗或更換，若進口端的填料發(fā)生堵塞，柱子將不可能被**恢復，只能通過去掉進口端的部分填料，重新填充進行有限的柱效恢復。而且修復的厚度是2-5mm 通過本文希望大家對**液相色譜柱的保養(yǎng)和維護方法有所了解。

液相色譜儀基線不穩(wěn)原因有哪些?

1、流動相中可能有溶解氣體。 用超聲脫氣15～30分鐘或用大氣脫氣。

2、系統(tǒng)中可能有漏液處。檢查病確定漏液的位置并排除。

3、泵的密封可能損壞，使泵壓不穩(wěn)。更換泵的密封。

4、柱子平衡膠慢，特別是更換流動相時。用中等強度的溶劑沖洗柱子。一般更換流動相時，先用10到20倍體積的新流動相沖洗。

5、單向閥可能堵塞。取下單向閥，用超聲在10%甲醇水中清洗30分鐘。

6、檢測器沒有設定在**吸收波長處。

7、柱子中有氣泡。

8、泵中有氣泡